Generati dal midollo spinale i motoneuroni in vitro per sostituire le cellule malate

Le terapie di sostituzione cellulare per patologie neurologiche utilizzano cellule staminali embrionali umane (hESC) o neuroni prodotti da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) per sostituire le popolazioni di neuroni danneggiate o malate. Per il midollo spinale sono stati fatti progressi significativi generando i motoneuroni in vitro necessari per ripristinare il movimento coordinato. Tuttavia, non esiste ancora un protocollo per generare in-vitrointerneuroni sensoriali anziani (INS), che consentono la percezione dell’ambiente. Qui, riportiamo lo sviluppo di un protocollo di differenziazione diretto per ricavare INs sensoriali sia per hESCs che per hiPSC. Due fattori rilevanti dal punto di vista dello sviluppo, l’acido retinoico in combinazione con la proteina morfogenetica ossea 4, possono essere utilizzati per generare tre classi di INS sensoriali: i dini1 propriocettivi, i dI2 e i dI3 meccanosensoriali. Critico a questo protocollo è lo stato di competenza dei progenitori neurali, che cambia nel tempo. Questo protocollo faciliterà lo sviluppo di terapie di sostituzione cellulare per ristabilire le connessioni sensoriali nei pazienti feriti.

introduzione
Il sistema somatosensoriale media la percezione del tatto (meccanosensazione), il dolore (nocicezione), il calore (termosensazione) e la posizione del corpo nello spazio (propriocezione). Queste modalità ci consentono di percepire e reagire all’ambiente; sono quindi essenziali sia per il benessere che per la sopravvivenza. Le informazioni somatosensoriali sono ricevute perifericamente e quindi decodificate centralmente da interneuroni (IN) nel midollo spinale dorsale ( Butler e Bronner, 2015 ), che trasmettono informazioni sensoriali a centri di ordine superiore nel cervello, compresi i sistemi motori nel tronco cerebrale e nel cervelletto ( Bermingham et al., 2001), così come all’uscita del motore dal midollo spinale. Classi distinte di INS sensoriali sorgono durante lo sviluppo embrionale: sono classificate come interneurone dorsale (dI) da 1 a dI6s. Questi neuroni hanno differenti modalità funzionali e sorgono attraverso distinti programmi di sviluppo in diverse posizioni nel midollo spinale ( Lai et al., 2016 ). Ad esempio, i dI1 mediano la propriocezione ( Yuengert et al., 2015 ). Nascono dai progenitori neuronali ATOH1 + (Math1) situati dorsalmente ( Helms and Johnson, 1998 ), e migrano verso la posizione più profonda nelle lamine V-VII del midollo spinale adulto al momento della maturazione ( Lai et al., 2016 ). Allo stesso modo, i dI2 e i dI3 sono derivati ​​da NGN1 + e ASC1+ (Mash1) progenitori, rispettivamente ( Helms et al., 2005 ), e stabilirsi in distinti strati del midollo spinale maturo. I dI3 mediano i comportamenti motori attivati ​​dal tocco ( Bui et al., 2013 ), mentre le funzioni dei dI2 sono attualmente sconosciute.

Lesioni del midollo spinale (SCI) possono influenzare sia i sistemi sensoriali e motori e sono debilitanti emotivamente e fisicamente. Si stima che gli SCI colpiscano oltre 1 milione di persone negli Stati Uniti, riducendo la loro qualità di vita e costando ~ $ 40 miliardi all’anno in sanità ( Armor et al., 2016 ). Le SCI sono state considerate intrattabili fino a quando le cellule staminali pluripotenti sono emerse come un notevole reagente per la comprensione dei meccanismi della malattia, fungendo da piattaforma per lo screening dei farmaci e fornendo una fonte di tessuto per terapie di sostituzione cellulare. Importanti pietre miliari per il trattamento delle SCI sono state l’istituzione di protocolli per derivare i neuroni motori spinali (MN) da cellule staminali embrionali di topo (m) e umano (h) (ESC) ( Li et al., 2005 , Wichterle et al., 2002) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ( Dimos et al., 2008 , Karumbayaram et al., 2009 ). I MN derivati ​​dalle cellule staminali hanno fornito una finestra importante per la comprensione della patologia delle patologie motorie, come la sclerosi laterale amiotrofica ( Sances et al., 2016 ) e l’atrofia muscolare spinale ( Ebert et al., 2009 ), permettendo anche la sostituzione cellulare in modelli di lesione ( Harper et al., 2004 , Thomsen et al., 2014). Mentre questi progressi aumentano la possibilità di riparare le funzioni motorie nei pazienti con LM, relativamente poca attenzione è stata data al recupero dei circuiti sensoriali che consentono al paziente di interpretare il loro ambiente sensoriale e modulare la produzione del motore. In particolare, non esiste attualmente un protocollo di differenziazione diretto per generare INs spinale sensoriale da cellule staminali pluripotenti umane, il primo passo fondamentale verso il recupero della somatosensazione nei pazienti con LM.

Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sviluppato un protocollo di differenziazione diretto che genera tre popolazioni chiave di INS sensoriali dorsali: il dI1s, il dI2s e il dI3s. Questo protocollo cooptula i meccanismi di sviluppo che prima stabiliscono questi neuroni nel midollo spinale dorsale embrionale. Il midollo spinale è derivato dal neuroectoderma posteriore come risultato di entrambi i segnali di posteriorizzazione, come l’acido retinoico (RA) ( Diez del Corral et al., 2003 , Molotkova et al., 2005 ) e gli indizi di identità regionale, forniti dal Geni HOX ( Forlani et al., 2003 ). Il midollo spinale più dorsale è modellato in particolare dalla famiglia delle proteine ​​morfogenetiche ossee (BMP), secreta dalla piastra del tetto (RP) sulla linea mediana dorsale ( Andrews et al., 2017 ,Hazen et al., 2012 , Le Dreau e Marti, 2013 , Liem et al., 1997 , Yamauchi et al., 2008 ). Le BMP derivate da RP dirigono i progenitori spinali dorsali verso tre popolazioni di INS sensoriali dorsali; il LHX2 + dI1s ( Liem et al., 1997 ), LHX1 / 5 + PAX2 – dI2s ( Caspary and Anderson, 2003 ), e Isl1 / 2 + TXL3 + dI3s ( Tsuchida et al., 1994 ). Queste popolazioni neuronali non si sviluppano in topi privi di recettori BMP di tipo I chiave ( Wine-Lee et al., 2004 ) o se l’RP è ablato in vivo ( Lee et al., 2000).

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Questo paradigma evolutivo suggeriva che l’azione combinatoria di RA e BMP4 avrebbe caudalizzato e dorsalizzato i progenitori neurali derivati ​​da hESC verso gli INS sensoriali dorsali, in un modo analogo ai protocolli per generare MN spinali derivati ​​da cellule staminali. Tuttavia, gli INS sensoriali dorsali si sviluppano su una tempistica diversa rispetto ai MN ( Andrews et al., 2017 , Le Dreau e Marti, 2012) ed è rimasto irrisolto se i progenitori spinali derivati ​​da hESC fossero ugualmente competenti a dare origine a MN e IN. Abbiamo quindi prima caratterizzato le transizioni del destino cellulare durante le prime fasi della neuralizzazione di hESC per determinare il punto temporale ottimale per aggiungere BMP4. Abbiamo quindi dimostrato che BMP4 indirizza le hESC verso i destini dI1 e dI3 all’interno di una finestra limitata temporalmente che è diversa da quella per i MN spinali. Inaspettatamente, i dI2 vengono osservati nelle condizioni di controllo RA e vengono soppressi dopo l’aggiunta di BMP4. Mostriamo inoltre che INs sensoriali derivati ​​da hESC esprimono marcatori assonali maturi del midollo spinale, suggerendo che rispecchiano funzionalmente le loro controparti endogene. Infine, abbiamo stabilito che questo protocollo indirizza le iPSC umane a differenziarsi in dI1 e dI3 con efficienza comparabile con hESC. Così, questi due tipi di cellule staminali pluripotenti possono seguire un programma di sviluppo simile per generare INs sensoriali. Presi insieme, questo studio apre la strada a un’ulteriore comprensione delle malattie del sistema somatosensoriale e alla progettazione di terapie di sostituzione cellulare per riconquistare la somatosensazione nei pazienti con LM.

risultati
Caratterizzazione della linea temporale con cui hESC perde la pluripotenza e entra nel lignaggio neurogeno
Abbiamo cercato di generare INs dorsale sensoriale spinale in-vitro modificando il protocollo utilizzato per generare MN spinale ( Wichterle e Peljto, 2008 ). In breve, questo protocollo indirizza le hESC verso i destini MN in tre fasi: le hESC vengono prima coltivate in un mezzo di differenziazione neurale (medium SaND) ( Sareen et al., 2013 ), per indirizzarle verso un lignaggio neurogenico. In secondo luogo, le hESC sono caudalizzate dall’aggiunta di RA ( Figura 1UN). Terzo, sono ventralizzati dall’aggiunta di un agonista di segnalazione del riccio sonico, come purmorphamine, per specificare l’identità di MN spinale. Abbiamo ipotizzato che l’aggiunta di proteina BMP4, anziché purmorpamina, agli hESC caudalizzati genererebbe INs sensoriali dorsali BMP-dipendenti, dato il ruolo delle BMPs che dirigono il destino spinale dorsale ( Andrews et al., 2017 , Liem et al., 1997 ). Tuttavia, gli INS sensoriali dorsali si sviluppano lungo una linea temporale diversa dai MN ventrale in vivo ( Andrews et al., 2017 , Le Dreau e Marti, 2012 ). Quindi, abbiamo prima valutato il momento in cui le hESC entrano nel programma progenitore neurogenico e spinale, per determinare il giorno ottimale in cui aggiungere fattori di crescita.

Abbiamo valutato quando le hESC perdono la pluripotenza e si inseriscono nel programma neurogenico esaminando i livelli di espressione e la distribuzione di NANOG, SOX2, PAX6 e SOX1 durante i primi 6 giorni di coltura bidimensionale in terreno SaND. NANOG è presente specificamente nei precursori indifferenziati ( Mitsui et al., 2003 ), le etichette SOX2 sia pluripotenti che neuroectodermiche ( Bylund et al., 2003 , Ellis et al., 2004 , Graham et al., 2003 ), mentre PAX6 e SOX1 sono marker pan neuroectodermici ( Pevny et al., 1998 , Walther and Gruss, 1991 ). Il numero di cellule NANOG + ( Figure 1 B’-1D ‘e 1H) e livelli di mRNA NANOG (La Figura 1 H) diminuisce rapidamente entro il secondo giorno del protocollo e non è rilevabile entro il giorno 4, suggerendo che le hESC escono rapidamente dallo stato pluripotente ( Figura 1 A). Al contrario, il numero di cellule SOX2 + ( Figure 1 B “-1D” e 1I) e il livello di trascrizione di SOX2 ( Figura 1 I) è rimasto stabile durante questo periodo di 6 giorni, indicando che hESC iniziano a sovraregolare il programma neurogenico di giorno 2. Questa ipotesi è stata supportata dall’osservazione che le proteine PAX6 RNA e PAX6 sono indotte dal giorno 4 e aumentano di giorno 6 ( Figure 1 B ‴ -1D ‴ e 1J). Allo stesso modo, l’ espressione SOX1 iniziata in hESCs dal giorno 2 ( Figure 1E-1G e 1K). Tuttavia, l’ espressione di SOX1 declina successivamente, con il picco di cellule SOX1 + al giorno 4 e una diminuzione di circa 5 volte nell’RNA di SOX1 entro il giorno 6 ( Figura 1 K). Insieme, questa analisi suggerisce che la coltura di hESC in terreno SaND consente loro di iniziare la neurogenesi. Tuttavia, questo stato non è sostenuto il 6 ° giorno, suggerendo che l’AR, un fattore pro-neuralizzazione ( Engberg et al., 2010 , Tonge and Andrews, 2010 ), dovrebbe essere aggiunto alle culture in questo momento.

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RA dirige le hESC verso i progenitori spinali con identità miste
Successivamente abbiamo valutato l’effetto dell’aggiunta di RA al giorno 6 sui destini neuroepiteliali nelle colture di hESC. Le hESC sono state autorizzate a formare corpi embrioidi (EBs) in terreno SaND integrato con 1 μM RA. I livelli di entrambi gli mRNA di SOX1 e PAX6 aumentano notevolmente, raggiungendo un plateau entro il giorno 10 (cioè dopo 4 giorni di esposizione RA) ( Figure 2 B-2D). Anche i livelli di SOX2 mRNA e SOX2 aumentano modestamente fino al 12 ° giorno, ma diminuiscono successivamente, suggerendo un’erosione dello stato progenitore ( Figura 2 E). Il calo dei livelli di SOX2 è correlato all’insorgere della differenziazione neuronale. Tuj1, un anticorpo che identifica i processi neurali ( Menezes e Luskin, 1994), inizia a decorare EBs umani (hEB) al giorno 10 e diventa robusto entro il giorno 14 ( Figura 2 I), suggerendo che i progenitori hanno iniziato a differenziarsi in neuroni post-mitotici.

Abbiamo anche determinato il lasso di tempo su cui RA induce gli hEB verso i destini dei progenitori spinali analizzando l’ espressione HOX , PAX3 e OLIG2 . Il profilo HOX indica il livello assiale ( Philippidou e Dasen, 2013 ), PAX3 è ampiamente presente nei progenitori spinali dorsali ( Mansouri e Gruss, 1998 ), e OLIG2 segna il dominio dei progenitori MN (pMN) ( Novitch et al., 2001 ). Un’esposizione di 2 giorni all’AR (giorno 8) è stata sufficiente per indurre HOXA5 , con un numero elevato di cellule HOXA5 + osservate entro il giorno 10 ( Figura 2 G). C’erano livelli marcatamente più modesti di HOXA9 e HOXA11, senza espressione di HOXD11 o HOXA13 ( Figure S1 D e S1E), a dimostrazione del fatto che gli hEB hanno generalmente adottato un’identità spinale cervicale rostrale. Tuttavia, le EBs contengono sia progenitori spinali dorsali che ventrale: l’ mRNA PAX3 e la proteina PAX3 sono presenti ad alti livelli al giorno 8 ( Figura 2 F), mentre l’ espressione OLIG2 inizia al giorno 10, ma non è robusta fino al giorno 16, quando molti OLIG2 + si osservano anche le cellule ( Figura 2H). Quindi, ci sono due fasi di azione dell’AR: una fase iniziale (giorno 6-10) in cui l’AR induce progenitori spinali dorsali e una fase successiva (dopo il giorno 12), quando l’esposizione prolungata all’AR risulta in progenitori spinale ventrale e l’insorgenza di differenziazione neuronale.

BMP4 induce gli eEs verso le soglie sensoriali dorsali all’interno di una finestra temporale specifica
Successivamente abbiamo determinato la conseguenza dell’aggiunta di BMP4 in aggiunta a RA alle colture di hEB. Studi precedenti ( Andrews et al., 2017 , Chizhikov e Millen, 2004 , Le Dreau e Marti, 2013 ) hanno dimostrato che BMP4 è sufficiente per dirigere le cellule ectopiche Lhx2 + dI1, Lhx1 / 5 + Pax2 – dI2 e Isl1 + Tlx3 + dI3 in midollo spinale di pollo embrionale. Abbiamo verificato che questi marcatori di identità dorsale sono conservati in modo evolutivo nei primati, valutando la distribuzione di Lhx2 e Isl1 negli embrioni di macaco Rhesus del giorno 28, uno stadio equivalente al topo di stadio 11.5 embrionale (E) ( Clark et al., 2017). Sorprendentemente, la distribuzione di Lhx2 e Isl1 era simile nei primati e nei roditori ( figure 3 B, 3C, 4 A e 4B).

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Abbiamo ipotizzato che l’aggiunta di BMP4 agli hEB esposti a un breve periodo di RA (cioè, dal 6 ° al 10 ° giorno prima della ventilazione o della differenziazione neuronale) sarebbe la condizione più probabile per indurre INs sensoriali dorsali. BMP4 (10 ng / mL) è stato aggiunto agli hEB trattati con RA ai giorni 6, 8, 10 e 17 ( Figura 3 A). Gli hEB sono stati coltivati ​​fino al giorno 36 e quindi analizzati per la distribuzione e il livello di SOX2, pHISTONEH3, LHX2, LHX1 / 5, ISL1 e PAX2. Gli EBs stanno ancora differenziando al giorno 36, con l’1% -2% delle cellule in mitosi ( Figure S2 A’-S2D ‘e S2J), e fino a ~ 50% delle cellule negli EB continuando a esprimere SOX2 ( Figure S2 A-S2D e S2I).

Coerentemente con la nostra ipotesi, l’aggiunta di BMP4 in qualsiasi giorno durante la fase iniziale dell’AR (cioè BMP4-D6, BMP4-D8 e BMP4-D10) ha comportato un aumento fino a 3 volte nell’espressione di LHX2 e > Aumento di 2 volte del numero di LHX2 + Tuj1 + dI1s ( Figure 3 E, 3F, 3H e 3I, vedere Figure S3 A-S3C per repliche biologiche) rispetto al controllo RA ( Figure 3 D, 3H e 3I) . Misurare il numero di nuclei LHX2 + / DAPI + all’interno di EBs ha suggerito un’efficienza di differenziazione media dI1 di ~ 20% ( Figura 3 I, riepilogata nella Tabella S3 ). Al contrario, non c’è stato alcun aumento significativo in entrambiEspressione di LHX2 o il numero di cellule LHX2 + Tuj1 + , quando BMP4 è stato aggiunto durante la fase tardiva dell’AR (cioè, BMP4-D17) ( Figure 3 G, 3H e 3I).

Allo stesso modo, l’aggiunta di BMP4 agli hEB durante la fase iniziale di RA ha portato a un aumento triplo dell’espressione ISL1 e fino a 3 volte più cellule ISL1 + Tuj1 + ( Figure 4 D, 4E, 4G e 4H, vedere Figure S3 D -S3F per repliche biologiche) rispetto al controllo RA ( Figure 4 C, 4G e 4H). Queste cellule ISL1 + potrebbero essere co-etichettate con TLX3, che segna un sottoinsieme di dI3 ( Muller et al., 2005 ) ( Figure S4 B, S4C e S4E-S4G), ma non con HB9, un marker di MN spinale ( Arber et al., 1999 ) ( Figure S4D e S4H), verificando la loro identità come dI3 dorsali. L’efficienza media di differenziazione dI3 è ~ 15% ( Figura 4 H, Tabella S3 ). Non c’è stato ancora alcun aumento significativo nell’espressione ISL1 o nel numero di cellule ISL1 + Tuj1 + , quando è stato aggiunto BMP4 durante la fase tardiva dell’AR ( Figure 4 F, 4G e 4H).

Sorprendentemente, non abbiamo trovato una condizione in cui l’aggiunta di RA + BMP4 fosse in grado di indurre il dI2, come è stato osservato negli embrioni di pollo in vivo ( Andrews et al., 2017 ). Piuttosto abbiamo scoperto che LHX1 / 5 + PAX2 – dI2s sono presenti nella condizione RA ( Figure S2 E e S2K-S2N), con un’efficienza media di differenziazione dI2 di ~ 15% ( Figura S2 K e Tabella S3 ). Al contrario, BMP4 sembra sopprimere il destino Di2: dopo l’aggiunta di RA + BMP4 v’è una diminuzione di 10 volte LHX1 o LHX5 espressione e una diminuzione di almeno 5 volte del numero di LHX1 / 5 + PAX2 – cellule (Figure S2 F, S2G e S2K-S2N).

Presi insieme, questi dati suggeriscono che i progenitori neurali sono i più competenti per generare INs sensoriali dorsali derivati ​​da BMP4 dopo una breve esposizione alla RA. Supportando questo modello, troviamo che l’ espressione di ATOH1 e ASCL1 è aumentata in hEB dopo l’aggiunta iniziale di BMP4 ( Figure 5 D e 5E). L’espressione ATOH1 (conosciuta anche come Math1) e ASCL1 (anche conosciuta come Mash1) definisce lo stato progenitore per il dI1s (cioè il progenitore dorsale [dP] 1 dominio) ( Figura 5 B ( Helms and Johnson, 1998 )) e dI3s ( cioè, dP3) ( Figura 5 C, Helms et al., 2005), rispettivamente. Questa finestr

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